技术问答

保留指数是什么?其目的是什么?

保留指数(Retention Index)又称科瓦茨(kovats)指数,是重要的定性指标。它需要采用一系列保留指数基准物质(如脂肪酸甲酯和正构烷烃)作为参考,将保留时间转换为指数。相比于保留时间,保留指数的特点是它只和色谱柱类型有关,而和其他仪器参数无关。例如,针对不同的生物样品,我们可能需要不同的升温程序,以达到最佳的色谱分离。此时,代谢物的保留时间就会发生改变,无法和质谱库中的标准时间进行匹配。再比如,色谱柱使用较长时间后,柱前端容易被严重污染,从而影响柱效。我们一般会将柱前端截断30-50公分(更好的方法是色谱柱前添加保护芯片)以恢复柱效。此时,所有代谢物的保留时间都会提前。保留指数不会受到这些实验条件的影响,依然可以用于准确定性。

GC/MS能检测到哪些类别的代谢物?

衍生化极大地拓展了GC/MS的检测分析范围。GC/MS能检测到有机酸、氨基酸、单糖、糖醇、胺类、脂肪酸、吲哚、单甘油酯、核苷、二糖、生育酚、甾醇和胆汁酸等代谢物。

GC/MS分析生物样本为何要衍生化处理?有哪些衍生化的方法?

GC的流动相为气体(通常为高纯氦),这就要求被分析物必须能够气化,而生物样本中很多内源性代谢物都含有极性基团,具有沸点高、不易气化特点。衍生化能够降低这些代谢物的沸点,增加它们的热稳定性,以便分析能够顺利进行。衍生化方法及试剂种类繁多,根据不同的分析目标,需选择合适的衍生化方法。如分析脂肪酸,我们可以采用甲酯化衍生。在GC/MS代谢平台上,最常用的衍生化方法是硅烷化衍生,因为它的广谱高效。在进行硅烷化衍生之前,还需添加甲氧胺吡啶溶液,以封闭羰基(针对α-酮酸和糖类,保护作用),减少衍生化副产物的生成。

GC/MS平台有哪些

目前,市面上和GC串联的质谱有多种,如TOF、Quadrupole、Linear Ion Trap、Orbitrap、Sector MS以及串接质谱如Q-TOF,TQ等等。目前在代谢组学领域应用最广泛的还是GC-TOFMS平台,因为它具有高通量、高灵敏和稳定性好等优势。对于靶向定量代谢组学,则可选择GC-TQMS。

使用临床样本进行代谢组学研究大概需要多少样本数量?另外如何控制临床样本的质量?

对于临床的样本建议每组最低50个生物学重复,如果能从大量样本遴选排除其他疾病干扰或者是性别、年龄、BMI指数均一的样本是最理想的,另外样本重复数越多数据结果越可靠。

是否可以通过代谢组学研究来预测肝脏疾病可能的损伤类型?

可以,最近我们做了一个很有意思的研究。通过对人群进行一定的负载,我们利用胆汁酸、脂肪酸(含短链脂肪酸)、氨基酸肉碱就能够很好的判断肝脏的损失情况,并且还有另外的一组数据显示,肝功能指标正常,胆汁酸的异常已经很明显,所以我们认为胆汁酸可以用于肝脏损伤的类型来研究。

对于临床样本而言,寻找生物标志物时个体差异太大了,请问关于找标志物组大概是怎么做的?
  1. 代谢组学首先要控制样本质量,性别、年龄、收集疾病用的正常对照要在同一家医院、如果多中心的(各个中心都要收集对照)这些可控的因素要控制好,后续虽然也有矫正方案,但不如开始的时候就考虑进去为好。
  2. 样本数目, 这个和疾病相关。
  3. 统计方法,多维统计的方法往往比单维统计在找代谢物组上有优势,两种方法互为补充和验证。