技术问答

如何选择血浆抗凝?

血浆是血液经抗凝、离心除去血细胞后得到的淡黄色液体。常用的抗凝剂有柠檬酸、EDTA和肝素盐等。其中,柠檬酸和EDTA是通过钙离子鳌合作用而抗凝,而肝素是通过激活抗凝血酶,抑制凝血因子而抗凝。代谢组学项目一般不建议选择柠檬酸作为抗凝剂,因为柠檬酸是机体内重要代谢通路——三羧酸循环的中间产物。而EDTA在NMR上会产生很强的噪音信号[5]。那肝素盐是否就是最佳的抗凝剂选择?有多篇报道表明肝素盐抗凝管会在液质上产生严重的干扰信号[2, 6],如下图3所示,经鉴定,这些干扰是聚乙烯醇的信号,可能来自于抗凝管中的塑料。因此,若选择质谱作为代谢组学检测平台,我们推荐EDTA作为血浆抗凝剂

图3. 肝素锂抗凝血浆的液质色谱图。

选用血清 or 血浆?

目前已被公认的事实是血清和血浆的代谢轮廓存在很大差异。如下图1所示,无论是液质平台(正负离子检测模式,图1-A,B),还是气质平台(下图1-C,D),血清和血浆样本在PCA等模型得分图上都有明显区分[2, 3]。相比于血浆,血清中溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、氨基酸和葡萄糖等代谢物显著升高,而丙酮酸、柠檬酸、尿酸和磷脂酰肌醇则显著降低[4]。因此,对于一个研究项目来说,我们只能选择同一种类型的样本。另外,从图1-D中我们可以发现,血清和血浆的代谢轮廓会随着孵化时间的不同而改变。这提示我们要确保样本收集过程的一致性。血清样本由于需要时间去凝结,尤其需要注意尽可能保证所有样品凝血时间的一致性。

图1. 血清和血浆样品PCA(A,B,C)和PLS-DA(D)得分图。

代谢组学关注的是不同个体间代谢轮廓的差异性。那么,血清和血浆的巨大差异是否会影响个体间的代谢轮廓?下图是将血清和血浆分别作PCA得分叠加图,从图上可以看出个体间的相对位置较为类似。对血清和血浆样本得分值作Mantel test,ESI+和ESI-模式下的相关性分别为0.72和0.88[2]。因此,血清和血浆样本均可以应用于代谢组学,但找出的差异生物标志物会有细微的区别

图2. 血清和血浆样品分别作PCA后的叠加得分图。

如何获得高质量GC/MS代谢组学数据?

实验设计先不谈,在仪器分析阶段,若想获得高质量数据,有以下几个方面需要注意。

1)前处理方法的一致性。不同实验人员操作方式不尽相同。因此,一个项目应当只由一个人负责前处理。推荐使用自动衍生设备,以减少人为的误差。

2)检测之前需确保仪器处于最佳工作状态。仪器的控制软件都有系统自检功能,可以快速便捷地核查质谱仪器的状态。但更重要的是气相色谱状态,推荐使用一组混标作为仪器质控。在每一个项目开始之前,先进行质控样检测,确认气相色谱的分离度和质谱的整体响应。

3)后期数据矫正,特别是对于大样本项目。我们可以在检测序列中加入随行质控样本(每个样品取少量后混合),在后期数据处理时,使用质控样本结合如LOESS之类的算法对整体数据进行矫正。

为什么有的代谢物会出不止一个峰?怎么处理?

这主要是由于衍生化反应造成的。当代谢物有多个活泼氢时,会产生三甲基硅烷基(TMS)取代数目不同的衍生产物。如甘氨酸会生成2TMS和3TMS取代的衍生物。即使衍生试剂过量,也很难保证不同TMS取代个数的产物比例会保持一致。因此,通常的做法是将同一个代谢物的所有衍生产物的面积进行加和。我公司自主开发的XploreMET软件会自动完成这一步骤。

代谢物的峰面积是如何计算的?

软件会对原始质谱数据做基线计算、平滑、峰查找和解卷积。在解卷积之后,软件会考察代谢物所有碎片的信噪比、碎片提取离子流图(EIC)的对称性以及碎片色谱峰的纯度(共流出干扰的程度),最终自动挑选出一个最优的定量离子(Quant Mass)。最终的峰面积是对定量离子进行积分所得。

什么是解卷积?

我们平常看到的总离子流色谱图(TIC)其实是软件根据质谱采集到的一个个数据点拟合出来的。每一个数据点背后就有一张质谱图。当两个或多个色谱峰没有分离开而共流出时,质谱采集到的数据点就是一张混杂的质谱图,包含了多个组分的碎片信息。如果直接用于定性分析会导致物质相似度的降低和组分的丢失。解卷积(Deconvolution)就是利用数学算法将色谱未分离的组分重新解析开,还原它们最真实的质谱信息。需要指出的是,解卷积不是万能的,好的色谱分离依然十分重要。

GC/MS如何提高定性准确度?

GC/MS的定性有双重标准,一是上文提到的保留指数,二是质谱信息的相似度(similarity)。不同于LC/MS的软电离源,GC/MS使用的EI源属于硬电离,能量较强且稳定,在将代谢物分子电离后,分子离子峰进一步碎裂产生丰富的碎片离子。因此,我们很难在GC/MS上看到分子离子峰。GC/MS提供的是代谢物的“指纹图谱”,将仪器得到的实际指纹图谱和质谱库(如NIST库)进行比对后,我们将会得到一个叫相似度的指标。保留指数和相似度都必须满足设定的阈值,软件才会给出色谱峰的定性结果。最后采用标准品质谱信息进行完全比对定性,也就是说只有经过标准品比对,代谢物才是被百分之百定性。