技术问答

粪便样本反复冻融的影响

如下图所示,冻融两次和三次的粪水样本和新鲜粪水样本在PCA图上存在明显区分,且可以分别和新鲜粪水样本建立稳健的OPLS-DA模型。反复冻融对氨基酸和尿苷有显著影响[1]。因此,粪便样本应当提前分装,避免反复冻融

图4.不同冻融次数粪水样本的PCA图和差异代谢物

粪水和原始粪便样本的稳定性

除了直接冻存收集的新鲜粪便,另一种方式是按1:2(粪便:水)或其他比例加入水或PBS,振荡后,超速离心获得粪水,以粪水的形式存储。如下图所示,新鲜粪便在-20℃放置1h后,代谢轮廓即发生了较为明显的改变[1] 。冻存24h后粪水的代谢轮廓更稳定,和新鲜粪水没有明显差异,但粪水在室温下放置5h及冷藏下放置24h以上,代谢轮廓开始明显偏移[1]。需要指出的是,粪水样品对于检测疏水性强的化合物并不适合。另外,冻干粪便也是一种选择。一般200mg的新鲜粪便可获得约40mg的冻干粪便[2]。Lee等[3]对比了粪水和冻干粪便的差异,发现粪水中疏水性的长链醇、酯和甾醇类损失明显。冻干粪便亦有缺点,即冻干的过程会损失挥发性的代谢物,如SCFAs[4]。

图3.不同温度和时间存储粪便和粪水样本的PCA图

粪便样本的运输

临床上收集粪便样本,可能会碰到病人在自己家中采集粪便的情况。此时,如何将粪便运送至医院是需要考虑的事情。如下图所示,相比于5h、10h和24h,粪便在室温和冷藏条件下放置1h,其代谢轮廓与新鲜粪便更为接近。但单独比较新鲜粪便和放置1h后的粪便时可发现,室温可致乙酸和戊酸含量显著升高,而琥珀酸和富马酸含量显著降低。冷藏存储则较为稳定,其代谢物和新鲜粪便无明显差异[1]。因此,患者在家中采集的新鲜粪便需置于冰上,并在1-2小时之内送至医院。

图2. 室温和冷藏不同时间的PCA图

粪便样本的异质性

从下图中可以看出[1],粪便收集器中不同位置取出的局部粪便样品和整体匀浆后的粪便样本(绿色)在PCA得分图上有较为明显的分布差异,且这种差异在不同个体之间是不一致的。相比于代谢物组,不同位置获得的菌群测序结果却差异不明显,为了方便存储,显然不可能把所有收集到的新鲜粪便冻存。因此,临床上冻存收集的新鲜粪便之前,需用无菌棒将样品混匀。

图1. 粪便不同部位代谢轮廓PCA图

冻融对代谢物是否有影响?

环境温度及变化均会对生物体内的小分子代谢物产生影响。若将超低温冰箱或液氮中的生物样本直接放置到室温环境,代谢物氧化降解或代谢酶活性恢复的时间差异,会引起代谢物组成和浓度的变化。因此,代谢组学样本的解冻需要在冰浴上缓慢进行。

代谢组学样品应尽量避免反复冻融。Helen等人发现尿液经过九次冻融后,其代谢轮廓的差异相比个体差异(相同颜色代表同一个体)要小(图5)[10]。另一篇报道也发现冻融对生物样本的影响并没有我们想象的那么大,但对临床样本而言会有个体差异[6]。某些个体的样品较为稳定,而有些个体的样品即使经过一次冻融,其代谢轮廓也会发生剧烈波动(图6 A&B)。另外,不同代谢物种类对冻融的敏感度也不同,如肉碱经过两次冻融后,其浓度显著降低(图6 C)。因此,我们建议在存储前有计划地将样品提前分装好,尽量避免反复冻融。生物样本冻融不超过六次为宜,且需在低温下缓慢解冻。

图5. 六个临床尿液样品反复冻融九次后的PCA得分图。

图6. 冻融对代谢轮廓的影响。

存储条件对代谢物是否有影响?

样品长期存储于液氮中是最理想的存储方式,但是需要不断补充液氮,操作成本高。实验室中最常见的存储方式是-20℃和-80℃冰箱。那么这两种方式会对代谢物产生怎样的影响?Helen等对比了在-20 ℃和-80 ℃存储不同时间下生物样本中代谢物的稳定性[10]。如下图所示,经过长达6个月的存储以后,-20℃和-80℃存储的样品整体代谢轮廓较没有明显差异,且和收集当天较为类似。但部分代谢物如蛋氨酸、B族维生素、DHA和EPA在-20℃下存储3个月以上会发生显著降解[11,12]。因此,推荐将样品存储于-80℃冰箱,并尽快送检。如果检测物质是易挥发、易氧化降解的,建议开展预实验。

图. 尿液样品PCA得分图。A:收集当天;B:1个月后;C:6个月后。空心的为负80度存储,实心的为负20度存储。

尿液收集是否需要加抑菌剂?

尿样收集具有无创和易于获得的优点,被广泛应用于代谢组学研究。由于尿液中细菌生长迅速,有些研究会在尿液中添加如硼酸和叠氮化钠等抑菌剂保护尿液样本不被污染。但这些外来化学试剂的添加不可避免地会对尿液中的代谢物产生不利影响[7]。抑菌剂并不能完全去除掉细菌,选择离心加微孔滤膜过滤的方式更佳[8]。另外,尿液样品在低于-25℃条件下储存时,添加抑菌剂和不加抑菌剂,样品的代谢轮廓没有差异[9]。因此,我们不建议在尿液样品中添加如叠氮化钠等抑菌剂。