在线讲堂
公开课回顾 | 基于表型策略了解肠道微生物在功能性胃肠道疾病中的作用
4月18日绘谱学堂第七期公开课–《 Understanding Gut microbial role in Functional Gastrointestinal Disorders using Phenotype-based strategy》由香港浸会大学助理研究员赵玲主讲,本期公开课针对慢病或轻症与健康个体表型无显著差异时,如何扭转常规研究思路进行探究做了深入浅出的详细介绍。参加本期课程的老师和同学们认真听讲并踊跃提问与交流,课后小编特别整理了一份Q&A分享给大家,以便您随时温习查阅。
本期课程首先从发病率、发病特点、发病原因等方面阐述了肠易激综合症(IBS)流行病学现状,对IBS相关机制、临床肠道菌群研究进行了总结。其次,根据IBS临床研究特点阐述了三种研究方案:
1)不同肠型分类研究,可用于特征性菌群轮廓及其与症状相关性的研究;
2)多组学表型研究,可用于临床诊断;
3)对疾病的特征性表型进行研究,可用于揭示菌群机制。
最后围绕IBS腹泻型患者胆汁酸排泄异常的机制展开深入研究,从胆汁酸成分变化、肠道菌群变化、粪菌移植、单菌定植等方面进行了验证。
更多代谢组学研究方法欢迎咨询
Q&A
Q1. 临床数据中,如何处理健康组和疾病组的菌群差异不显著的问题?
A1:临床检测中这种数据的存在很常见,在很多情况下,特别是功能型疾病中,可能受病人生活习惯影响,肠道菌群的变化可能会相对较弱。因此在做临床研究收集病人粪便之前,建议设计一套完善的临床调研问卷,除生化指标以及临床诊断指标之外,尽可能多的收集病人的生活、作息、饮食习惯等信息,深入到某些特定人群去针对性的研究他们的菌群变化。
Q2. 为什么会出现病例与健康差异不大的现象?
A2:主要有以下两个主要方面:
1.疾病不是很严重,没有器质性病变,肠道内环境或许与健康人群差异不大;
2.采样问题,尤其是做粪便的采样,如遇到非住院病人采样,不能统一饮食、统一作息、集中采样,患者比较难严格按照要求做好准备工作、采样、送样等,这些都可能导致临床病例-健康对照菌群差异度不大,且远远复杂于动物实验。
Q3. 如何做好肠道菌群临床研究?
A3:临床菌群研究不应仅是单纯的肠道菌组成检测。首先,应该充分评估菌群在目标疾病的发生、发展和/或临床管理是否确实存在重要的潜在研究意义;同时,在菌群组成和/或功能改变的基础上,充分探索、挖掘这些改变是否能够有益于解决或部分解决临床关键问题。充分考虑这些问题菌群研究才能保证质量、具有转化意义。
Q4. 当正常组和病例组菌群差异不大时会根据病例组的cutoff值选择一部分人和健康组比较,如何选这个cutoff值?
A4:临床cut-off值一般采用90% 或者95%。
Q5. 胆固醇代谢生成胆汁酸,在原料没有增加的情况下,为何胆汁酸排泄会增多?
A5:首先,人每天只会排出5% 的总胆酸,仍有95%存在于体内进行肝-肠循环。合成和排泄速率是相当的,需要用来合成胆汁酸的胆固醇非常有限。其次,问题不一定出在源头胆固醇,胆固醇可以从食物摄入,也可以自身宿主合成,它在体内含量应该远大于胆汁酸的合成所需,一部分的胆固醇用来合成胆汁酸,其他的胆固醇会合成其他固醇类的代谢物如激素。即使病人每天会比正常人排泄的多,需要的合成量会更高(腹泻病人约高于健康人1-2倍),底物原料胆固醇也完全能够满足胆汁酸合成所需。简而言之,胆固醇的变化可影响胆汁酸的代谢,胆汁酸的变化并不一定受胆固醇影响。
Q6. 如何鉴定菌群在脱羧过程中的作用?
A6:首先要对菌群在胆汁酸转化过程中的作用相关文献进行整理,尤其是一些综述类文章,对菌群的作用有一个比较充分的认识。目前菌群在胆汁酸转化方面的研究已经有很多,但仍有欠缺。关于一些转化功能基因会产生怎样的胆汁酸或者具体的功能序列如何,暂时没有办法进行详细描述,部分基因/蛋白数据仍未解析。可能是因为有些菌群是不可培养的,导致在体外了解菌群的转化过程活性的数据缺失。本研究提到的7-位脱羧和异构是研究相对成熟的,目前已知的主要几个反应以7-位脱羧、7-位异构、3-位异构和12-位异构为主,因为含量比较高,以及表达这个基因的菌群是可培养的,这些数据已经获知。但胆汁酸结构上不只这几个关键位点,其他位点的异构数据暂时不全。
Q7. 肠动力如何检测?
A7:肠动力检测有多种方法,常用方法为计算60分钟或120分钟内粪便排出频率,也可以收集特定时间段内老鼠排便的个数。另外,也可用口服标记物(如胭脂红),计算从口服时间点到排出的时间点的长短,以上不需要处死动物。针对小肠推进或者特定肠段动力检测如碳墨推进法,需要将老鼠处死观察肠道黑色碳墨的推进速率。对于动物实验来说,尤其是菌群研究,该方法会影响后续内容物的采集以及菌群的分析。可以根据实验的实际情况,自行判断选择最优方案。
Q8. 菌群如何刺激细胞?
A8:最常见方法为共培养细菌,把菌群提取物、蛋白提取物或者细菌本身加入细胞。可以通过分层培养法,细胞在下面,上层加入细菌相关干扰因素。不过这里需要考虑细菌对细胞的毒性,细菌培养液会有强酸性或者细菌的次级代谢物会使得细胞不能生存。如何设计细菌与细胞互作实验,需要根据研究目的来确定。
Q9. 肠道菌群干预细胞实验中,如何进行菌群灭活操作?
A9:菌群灭活有不同操作方法,最常用的是高压灭菌,也有巴氏杀菌法,60℃左右持续不断的低温杀菌。根据研究目的进行选择。
Q10. BSH怎么测?
A10:对于BSH表达,目前无法用PCR方法测定,因为BSH在大部分肠道菌中都有表达,不同的菌有不同的BSH序列,所以只能通过基因组来衡量它的总表达含量和累积含量,或者通过基因组归属到某一特定菌种菌类来看BSH的表达量。对于BSH活性,可通过产物(游离型胆汁酸)与底物(结合型胆汁酸盐)含量的比例判断。
Q11. 与胆汁酸代谢相关的基因可以从哪些数据库查到所属的菌种?
A11:KEGG数据库:输入胆汁酸代谢,会有初级和次级胆汁酸代谢两条通路,次级胆汁酸通路里查看某一代谢酶,点进去会有KO值,在KO值的基础上查看taxonomy,就可以查看哪些菌种可以表达相关基因。也可以采用https://www.uniprot.org/,如“BaiE”,可以分别用KO_ID, baiE 或者 Bile acid 7-alpha dehydratase 检索,结果可能会不太一样,提到的菌种需要结合文献查阅确定它们是否真的有转化活性。
Q12.热图中菌群门水平与属水平是否能一起与胆汁酸盐水平做相关性分析,还是需要两个水平分别做?
A12:这个要取决于老师的研究目的,图只是表达数据的一个方式而已,如果关注到的菌群跟胆汁酸盐相关,那不管是门水平、属水平、种水平还是功能基因水平,都可以做相关性,一般建议分别进行相关性分析。
Q13. 如何进行菌群定植?
A13:常采用强饲法,也可以通过灌肠。强饲法会有一定损耗,因为胃酸会有一定的杀菌功效,所以在定植之后通常会对灌注的菌进行测定,以评价这个菌是否定植成功。